������������
�����������������
������������������������
���������������������
| Microscopy
PerkinElmer
�����������������
, Inc.
������������������������������������������������
Spinning Disk Microscopy
�����������940 �����Winter St.
�����������������������
�
��������������������������� �
���������������
Waltham,
���������
MA 02451
����������������������������
�����������������
(800) 762-4000 (US & Canada) or (+1) 203 925-4602
������������������������������������
���������������������������
�����������������������������
���
���
������������
�
ctinfo@perkinelmer
������
���������
������
�������
���
.com
����������������������������������������
www.perkinelmer.com/ATPLite_protocol
���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������� ���������������
��
���������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������������
���������� ������������������������������������������������������������
���������������������������������������������������������
Photoswitc
�������������������������������������������������������������
hing and Vesicle Trac
������������������������
king Applications for the Ultr
����������������������������
���������������������������������������
���������������
aVIEW
������������
�����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������� ������������
���������
PhotoKinesis
�������������
������������������
�����������������������������������������
����������������
Accessor
���������������������
y
������������
����������������
�������������
������������
�����������������������������������������
�������������������������
�
���������������
������������
����������
���������������������������������������������������������������
������������
Introduction
�������������������������
�
�������������������������
���������������������������������������������������������������
�������������������������
�������������������������
�������������
�������������
���������������������������
�����������������������������������������������������
Example Results��������������������������
��������������������
��������������������
�����
Dynamic
�����������������������������������������������������
live cell experiments
����������������������
such
����������������������
as FRAP
���������
(Fluorescence
���������
Recovery
��������������After
��������������
Photo-bleaching) ���������������
���������������
require the ability to target concentrated
�����������
laser illumina
������������������������
tion onto a user
����������
-defi
����������������
ned ROI (Region Of Interest),
�������������������������������������������������
while �����������minimizing ������������������������photo-bleaching associa����������
�������������
ted with ����������������sequential image
�����������������ca�������������������������������������������������pture. The ���������������������������UltraVIEW
®
PhotoKinesis
TM
�
������������������������ Accessory �������������enables these
��
techniques.
����
�����������������
�������������
In
������������������
addition,
���������������������������
it can
��������������������
be used
�
to
������������������������
perform
�����������
vesicle tracking
����������������
experiments,
����������������������������������������������
�������������������
when
������������������
used with photoswitchable
��������������������
or photoactiva
�����������
table
�
proteins.
������������������������������������������������������������������
�����
����������������
���������������������������������������
����������������������������������������������
����������������������
�������������������������������������������������������������
��������������������������������������������������
�
�����������������
����������������������������
Photoactivatable proteins
��������������������������������������������
������������
such as
���������
PA-GFP
�������
(1),
���������
�������
Dronpa (2) and PS-
�������������
��������CFP2 (3) ����������������������represent one of �����������������the most promising ����������������������approaches
������
to
�����������������������
in vivo
������������������������������������������������
���������������������
investiga
�������������������������������������������������������������
tions
��������������������������
of protein lifetimes,
����������������������
transport and turnover
���������������������������������
rates.
�
��������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������
����������������
In
����������������������������
this study
��������������������������
PSCFP2 was used,
������������
��������������
it is a photoactiva
������������������
table
�������
���������������������������������
dualcolor
�������
��
��
protein
��������
��������������������������������������������
capable
����������������������
of irreversible photo-conversion
�����������������
����������������
from
����������������������
F
a cyan
������
ig 1.
�����������������������
Hela cells transiently
����������������������������������������������
transfected with the empty vector PSCFP2-C1
���������
to green
�������������������������������������������������������������������
����
.
U
fl
���������������������
uorescent form in
��������������������������
response to 405 nm light
����������������������
���������������������������������
sing the UltraVIEW Photokinesis
��������
Accesso
�
r
irradiation.
�������������
High pH
�������������������
��
y
�����������������������������
, one cell in the area chose
�����
n, was
������
s
�����������
uccess
�
full
���������������������������������������������������
y photoswitched within 2 seconds using 405 nm excit
������
ation
����
at 100%
���������������������������������������������
stability ����������������before photo-activa��������������������������tion allows
��������������
targeting ��������������PS-CFP2 ���������to acidic
�
p
���������������������������������
ower and 200 bleach cycles.
����
organelles ����������������������������������������������such as endosomes and lysosomes.���������������
�
��������������������������������������������������������PS-CFP2 was
� used
������������������������������������
as a photoswitchable tag to stud
�������������������
y traffi ckingof
�����������
SNX1. SNX1 has been V
���������
isualiza
��������������������������
tion of PSCFP2-C1 was per
�����������������������
formed with 405 nm exci
������������������
tation and
���������������������������������������������������������
implicated in the regulation of intracellular sorting
����
of internalized
t
�������������
racking using 4
������������������
������
88 nm at 100% la
��
s
��
er power.
����������������������������������������
�
cell
���������������������������������������������
surface receptors. The UltraVIEW
��������������
����������������������������������������������������������
PhotoKinesis
��������������
accessory can be
used to investigate the photo-switching capabilities of PSCFP2
���������������������������������
�
��������������������������������������������������������
and
����������������������������������������������
�������������������������������������������������
�������������������������������������������������������������������������
intracellular traffi
������������������������������������
cking of SNX1.
�������������������
�����
�����������
���������������������������������������������������������������������������
������������������������������������������������������������
����������������������������������������������������������������������������
������������������������������������
���������������������������������������������������������
����������������������� ������������
����
�����������������������������������������������������
��������
Method
����������������������������������������
�������������������������������������������������������
�
��������������
�����������������������
�����������������������The Sorting Nexin ��������SNX1 was ���������������successfully ������������������sub-cloned into PSCFP2-
�������������������������������������
C1
���
and
����������
PS-CFP2-N1.
������
Hela
��������������
cells
�����������������������
were
�������������������������
seeded at 15x10
���
4
cells
���
in
��
glass
���������F�
��������������������������������
ig 2. Hela cells were transient
����������������������������
ly transfected with GFP-SNX1
������������������
. Using the Ultra-
���������������������������������������������������������������
bottomed
������������������
chambers
�������
(MatT
������
ek) for
������������������
24 hours. The cells were
����������������������������
then
V
��������������������������
IEW ��������������Photokinesis ��������������������accessor
�
y
��
,
����������������������������
an end������osome was successfu
�������
lly isol
����������
ated using
���������������
transiently transfected
���������������
with
����������������������������
3 µg of PS-CFP2-C1,
����
PSCFP2-
��������������������������������
N1 and
a
�����
regi
���������������������������
on �������of inter�������est (RO��������������������I) in a
�������������
‘doughnut sha
����
pe’
������������
. Once isola
����
ted,
���������������
more detailed
������������������������������
������������������������������������������������������������
��������������������������������� �����������������������i
���
nfo
����
�����������
rmat
�����������������
ion o
��
n
������������
vesicle fo
����
rma
����������������
t
������������������������
ion and ve
�
sicular traff
1 µg GFP-SNX1 using Genejuice
®
transfection reagent (Nova
��
i
����������������������
cking can be obtained.
��
�����������������������������������������������������������
����������
gen
®
������������������������
).
G
�Live cell ima����������ging was performed 24-48 h la���� ter in Dulbecco’
������������
FP-SNX1 imag
�
i
������������
ng was perf
��������������������������������
ormed through an EGFP (Ex 488 nm
��������
, Em 500-
�������������������������������������s modifi �������������������������
�ed Ea�����
��������
�����������������������������������������������������������gle medium (DMEM).
�������������������������������������������������������
5
����������������������������
�����������������
50 nm) standard
��
f
����
i lte
��
r.
����������������������������������������������������������������
���������
Fluorescence
�������������������������������������
�����������8
ima
��������
ging
��������������
of
��������
living
����������������
cells
�����������
�����������������������
����
was
�������������
performed
�������������������
with
�������
���
���������������
�
the
Acknowledgments
�����������������������������������������������������������57
UltraVIEW ���������������������������������������������������������������ERS confocal live cell imager. We applied 405 nm laser
W
�
e
���������������������������
would like to thank Dr. Konstantin
��������������
Lukyanov
��������������������
and his group at the
������
po���������������wer, 6 mW, for ���������������PS-CFP2 photos����������������������������witching of the whole cell using ����
Institute
��������������������������������
of Bioorganic Chemistry
�������
RAS a
�������
t Mosco
��������������������
w for supplying the
ProtocolGuide06-07.indd 63the
������������������������������
PhotoKinesis Accessory. Total photos
�������������������������
witching time for living
PS-CFP2 and Miriam Bujny and Prof. Pete Cullen at Bristol University
�������� ����������������������������������
11/10/06 11:33:59 AM�������������������������������
cells was between 1-2 seconds, with 2x2 binning mode, 1 second
for cloning SNX1 into PSCFP2.
����������������������������������
exposure �����times �����and ���using �� the x100 objective 1.45 NA oil immersion
��������������������������������������������������������������
lens,
������
for
�����������������������������������������������������������
PS-CFP imaging through ECFP (Ex 405 nm, Em 420-475 nm)
The work was funded by the EU integrated project on Molecular
����������������������������
and EGFP (Ex 488 nm, Em 500-550 nm) standard fi lters.
Imaging LSHG-CT-2003-503259.
����������������������8����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������57
Protocol Guide ı 2008 View entire protocol online at
www.biotechniques.com/protocol ı BioTechniques ı 55
ProtocolGuide06-07.indd 63 11/10/06 11:33:59 AM
PerkinElmer Spinning.indd 55 10/26/07 11:53:29 AM
Page 1 |
Page 2 |
Page 3 |
Page 4 |
Page 5 |
Page 6 |
Page 7 |
Page 8 |
Page 9 |
Page 10 |
Page 11 |
Page 12 |
Page 13 |
Page 14 |
Page 15 |
Page 16 |
Page 17 |
Page 18 |
Page 19 |
Page 20 |
Page 21 |
Page 22 |
Page 23 |
Page 24 |
Page 25 |
Page 26 |
Page 27 |
Page 28 |
Page 29 |
Page 30 |
Page 31 |
Page 32 |
Page 33 |
Page 34 |
Page 35 |
Page 36 |
Page 37 |
Page 38 |
Page 39 |
Page 40 |
Page 41 |
Page 42 |
Page 43 |
Page 44 |
Page 45 |
Page 46 |
Page 47 |
Page 48 |
Page 49 |
Page 50 |
Page 51 |
Page 52 |
Page 53 |
Page 54 |
Page 55 |
Page 56 |
Page 57 |
Page 58 |
Page 59 |
Page 60 |
Page 61 |
Page 62 |
Page 63 |
Page 64 |
Page 65 |
Page 66 |
Page 67 |
Page 68 |
Page 69 |
Page 70 |
Page 71 |
Page 72 |
Page 73 |
Page 74 |
Page 75 |
Page 76